Органы из пробирки

Органы нашего тела устроены сложнее, чем любая фабрика. Попытки их воспроизведения в лабораторных условиях подходят все ближе к пониманию тонкостей их устройства. 8 Ноябрь 2015, 10:35
В поисках способа создания органов человеческого тела в лаборатории исследователи прошли долгий путь. Искусственные живые ткани уже используются в медицинских исследованиях и даже вступили в стадию клинических испытаний. Но они гораздо проще, чем натуральные.
Чтобы сделать желудок, в лаборатории можно напечатать на 3D-принтере форму и заселить ее соответствующими клетками. Но без обратной связи от кровообращения и взаимодействия с другими тканями получится просто желудкоподобная модель, которая не может переваривать пищу. Орган — это гораздо больше, чем масса клеток, расположенных в определенной конфигурации, в нем имеются также опорные структуры, кровеносные сосуды, доставляющие питание, молекулы-сигналы гуморальной регуляции, сложноподчиненная система функций управления, отвечающих на внутренние и внешние сигналы, и так далее.
Все это делает задачу создания функциональных, физиологически эквивалентных органов в лабораторных условиях достаточно сложной, говорит Розмари Хунцикер (Rosemarie Hunziker) из Национального института здоровья США, которая занимается финансированием программ, посвященных проектированию и созданию искусственных органов.
Сложной, но не непреодолимой. Попытки воспроизвести органы во всей их биологической сложности идут в нескольких направлениях. Одно заключается в размещении клеток в сложных, но все еще упрощенных моделях органа размером с предметное стекло микроскопа, которые затем могут быть соединены в систему для исследования взаимодействия органов. Эти миниатюрные т. н. органы-«микрочипы» поставляют уникальные данные о функционировании здоровых и больных органов, а также используются для испытаний лекарственных веществ на токсичность. Еще один подход заключается в стимулировании способности клеток к самостоятельной сборке в надежде, что они будут повторять естественное развитие органа и давать понимание сути этого процесса.
При любой стратегии исследователи могут начать с простых в биологическом смысле подходов, а затем понемногу усложнять модель. 
Из стоволовых клеток в определенных условиях можно получить организованные кластеры, называемые органоидами, как, например, эта модель мозга, синтезированная исследователями Института молекулярной биотехнологии при Австрийской академии наук. У нее отсутствуют кровеносные сосуды и мыслить он не в состоянии, однако по сложности похож на мозг девятинедельного человеческого эмбриона
«Насколько именно искусственный орган должен быть похож на настоящий, зависит от поставленных задач», — говорит Хунцикер. Искусственные органы могут сильно отличаться по виду от оригинала, но тем не менее эффективно использоваться для испытаний лекарств и фундаментальных исследований.
«Как в научном аспекте, так и в медицинском конечной целью является создание органа или системы органов, которая функционирует так же надежно, как настоящая», — добавляет она.
Исследователи по всему миру используют такие системы для поиска ответов на множество важных вопросов — например, как именно раковые клетки отделяются от опухоли и вторгаются в другие ткани, или для воспроизведения процессов роста и заболевания тканей, чтобы понять, в частности, как возникают нарушения развития нервной системы.

Системное мышление

Самыми высокотехнологичными моделями органов являются органы-«микрочипы», меньше всего с виду похожие на натуральные. Они производятся по приблизительно той же технологии, что и кремниевые компьютерные микрочипы. На слой светочувствительного материала на кремниевой подложке с помощью ультрафиолетового луча наносятся бороздки в силиконовом полимере по определенному рисунку. По этой модели создается трехмерная структура из трубочек внутри полимерной полоски размером с современную миниатюрную карту памяти.
Внутренняя поверхность этих трубочек заселяется клетками желаемого типа, а сами они подсоединяются к внешнему источнику циркулирующей жидкой среды, имитирующему систему кровоснабжения, доставки питания и сигналов от других органов. Непрерывное течение этой жидкой субстанции воспроизводит естественную динамическую среду организма. Еще такая конструкция позволяет биоинженерам модулировать жесткость изучаемой ткани, а также воспроизводить аналоги механических, химических и электрических сигналов, получаемых клетками ткани в здоровом или больном состоянии, — говорит Джон Виксво (John Wikswo) из университета Вандербильта в Нэшвилле, штат Теннесси (см. врезку).
Исследователи могут, например, воспроизвести воспаление, вводя в канальцы «микрочипа» молекулярные агенты, называемые цитокинами, и даже живые иммунные клетки — и наблюдать ответную воспалительную реакцию, характерную для большинства тканей при повреждении или инфекции.

Есть контакт!

Несколько органов-«микрочипов» соединены в систему, физиологически подобную человеческой. Создатели установки собираются изучать на ней распространение метастазов рака груди в мозг. 
1) Этот элемент измеряет метаболическую активность клеток — уровни глюкозы и лактата, содержание кислорода, скорость окислительных процессов.
2) «Микрочип» мозга заселяется клетками кровеносных сосудов человека, нейронами, полученными из стволовых клеток и вспомогательными клетками нервной системы, астроцитами и перицитами.
3) «Микрочип» молочной железы, заселяемый здоровыми или раковыми клетками
Дэн Донген Хах (Dan Dongeun Huh), Институт Уисса Гарвардского университета, наблюдает развитие событий на клеточном уровне в микрочипе легкого
По словам Дональда Ингбера (Donald Ingber), директора Института бионики Уисса Гарвардского университета в Бостоне, штат Массачусетс, сами «чипы» обычно прозрачны и позволяют вести съемку с высоким разрешеним и в режиме реального времени.
Уже созданы микрочипы с образцами тканей печени, почек, легких, кишечника, жировой и мышечной ткани, а также структурной основы гематоэнцефалического барьера.
Далее из этих чипов собираются системы из нескольких органов для воспроизведения определенных физиологических процессов. Гордана Вуньяк-Новакович (Gordana Vunjak-Novakovic) и ее команда в Колумбийском университете в Нью-Йорке строят модель кровоснабжения сердца и печени для исследования заболеваний и токсичности лекарств. Виксво из университета Вандербильта и его коллеги из университета Питтсбурга, штат Пенсильвания, с помощью таких систем «микрочипов» исследуют влияние потенциально токсичных химических и лекарственных веществ.
Виксво считает, что модель из «чипов» печени и почек может выявить проблемы безопасности прежде, чем новое лекарство дойдет до стадии тестирования на людях, поскольку в этих органах токсичность проявляется в первую очередь. Для эмуляции природных состояний здоровья или болезни соответствующие клетки можно выращивать на трехмерных опорных структурах и изучать их реакции на сигналы, подаваемые в систему, — говорит Виксво.
Главное в деле успешного подражания природе — внимание к микроструктуре, — говорит Хунцикер. Специальное размещение клеток печени на чипе лучше имитирует реальную ткань печени, которая имеет различные зоны, близкие и далекие от основного кровоснабжения. В клетках разных зон активируются разные гены, что приводит к различиям в клеточном развитии и поведении, а также различным реакциям на химические воздействия, говорит она.
По словам Ингбера, на таких микросистемах органов можно ставить эксперименты, которые невозможно проводить на клеточных культурах, животных или людях. «Микрочипы», заселенные клетками отдельных пациентов, позволяют оценить физиологические различия между здоровьем и болезнью, а также между разными людьми, более подробно и в течение более длительного периода, чем было бы целесообразно в эксперименте на людях или животных, говорит он. Один из экспериментов команды Ингбера с системой «микрочипов» продолжался более месяца. Также в микрочипе можно так изменять входные параметры для получения различных эффектов, что невозможно сделать в случае с пациентом.
Некоторые из научных лабораторий создали дочерние компании для коммерческого использования своих моделей. Компания Emulate в Кембридже, штат Массачусетс, основанная Ингбером, разрабатывает системы органов на «микрочипах» для масштабного наркологического скрининга и испытаний на токсичность. Компания Hepregen в г. Медфорд, штат Массачусетс, соучредителем которой является биоинженер Сангита Бхатия (Sangeeta Bhatia) из Массачусетского технологического института в Кембридже, использует технику микропаттерна для разработки моделей печени с прецизионным размещением разных типов клеток, что более точно имитирует сложное строение печени.
Их модели также предназначаются для скрининга наркотиков. HemoShear Therapeutics в г. Шарлоттсвилль, штат Вирджиния, основанная двумя специалистами Университета Вирджинии, разработала несколько систем моделирования органов, в том числе такую, которая выборочно имитирует кровоснабжение в тканях. В январе HemoShear начала сотрудничество с нью-йоркской фармацевтической компанией Pfizer для поиска методов прогнозирования повреждений кровеносных сосудов, таких, как воспаление, вследствие применения новых лекарственных препаратов.
На сегодняшний день производство «микрочипов» для многих лабораторий недоступно, однако есть несколько компаний, предлагающих услуги по их производству для исследователей, не имеющих необходимого оборудования или опыта. Возможности по их созданию имеются также у многих университетов с их базовыми центрами обслуживания. Тем временем на переднем крае продолжается работа по совершенствованию «микрочипов» в качестве среды развития живых клеток. Одной из проблем является равномерный посев клеток по всем устройствам и поддержание их роста в канальцах, — говорит Ингбер. Другой является то, что клетки могут быть повреждены пузырьками в системе.

Трехмерные подпорки

В отличие от органов на чипах, гораздо более реалистично выглядящие искусственные органы могут быть созданы путем заселения клетками мягких каркасов. При этом подходе ряд синтетических материалов используется для создания опорной структуры, которая затем заселяется клетками, которые растут и развиваются на всем каркасе, образуя нужную конфигурацию. В одном известном примере из ранней стадии этих исследований Линда Гриффит (Linda Griffith) из Массачусетского технологического института и Чарльз Ваканти (Charles Vacanti) из Массачусетской городской больницы в Бостоне, а также их коллеги использовали такой каркас, имплантированный под кожу мыши, чтобы заставить клетки бычьего хряща расти в форме человеческого наружного уха. По мере роста ткани полимеры каркаса деградировали, оставив после себя структуру из хряща.
Сегодня Гриффит и ее команда создают чрезвычайно сложные каркасы для роста тканей с помощью особого 3D-принтера. Сопло принтера распыляет светочувствительный полимер, каждый слой подвергается воздействию ультрафиолетового света для стабилизации, затем материал-основа удаляется, а процесс повторяется до получения нужной детали в микронном масштабе.
Разработаны также способы имитации механических раздражителей, которые, по-видимому, играют важную роль в развитии тканей. Например, на ранних стадиях развития зубов в эмбрионах млекопитающих эмбриональные клетки уплотняются друг относительно друга. Для имитации этого процесса лаборатория Ингбера разработала полимер, который при определенных температурах действует как термоусадочная пленка: если его нагреть до температуры тела, он сжимается и уплотняет заключенные в нем клетки, что активирует в них гены, ответственные за развитие зубов. По словам Ингбера, этот материал потенциально также может быть использован в выращивании тканей для различных видов терапии, так как хрящи и другие части тела, такие, как легкие и почки, тоже подвергаются клеточному уплотнению по мере развития.
Отдельную сложность в моделируемом органе представляет воспроизведение кровоснабжения, особенно при попытке имитировать сердце, которое ритмично качает кровь в течение всей жизни. Тем не менее есть определенный прогресс в поисках методов лечения повреждений сердечных тканей, и в конечном итоге, возможно, достижении альтернативы пересадке сердца. Начав с производства клеточных листов (слой клеток в одну клетку толщиной), не требующих каркаса, Теруо Окано (Teruo Okano), биомедицинский инженер Токийского женского медицинского университета, и его коллеги создали образцы васкуляризированной сердечной ткани.
В начале эксперимента получают тонкие клеточные слои, которые уже умеют выращивать из различных типов клеток, в том числе сердечных клеток новорожденных крыс, мышечных клеток человека и индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клеток. Эти листы выращивают в чашках, покрытых слоем термочувствительного полимера. При понижении температуры можно отделить лист из клеток, которые остаются соединенными друг с другом без каких-либо каркасов, говорит коллега Окано Тацуя Симидзу (Tatsuya Shimizu).
В ходе продолжающихся клинических испытаний команда наблюдает 30 пациентов с заболеваниями сердца, которым имплантировали патчи, сделанные из листов мышечных клеток. Эти листы выделяют несколько типов цитокинов, которые способствуют образованию кровеносных сосудов и ингибируют гибель клеток в сердечной ткани пациента. В будущем Симидзу и его коллеги надеются пересаживать ткани с сократительными сердечными клетками.
Но клеточные листы все-таки не являются оптимальным решением. Идеальный трансплантат должен иметь определенную толщину, особенно учитывая, что такие события как сердечный приступ приводят к истончению ткани сердца. Команда принялась за работу над созданием более толстого образца, куда сможет проникнуть большее число кровеносных сосудов и который сможет дольше предыдущих образцов оставаться жизнеспособным. Они вырастили листы из индуцированных плюрипотентных клеток человека и пересадили их крысам под кожу на спине так, чтобы образовались лоскуты, состоящие из 30 слоев клеток в миллиметр толщиной каждый.
После пересадки мелкие кровеносные сосуды организма-хозяина (крысы) проросли сквозь слои. При перемещении меньших образцов в более васкуляризированные области удалось вызвать рост все большего числа кровеносных сосудов и в конечном итоге подключить образец непосредственно к крупным сосудам — в частности, яремной вене. Сократительные сердечные клетки продолжали пульсировать в течение шести месяцев наблюдения.
Тем не менее для людей подобные множественные хирургические вмешательства неприменимы. Поэтому был разработан метод с использованием гелевой подложки, на которой в лабораторных условиях удалось вырастить несколько слоев клеток крысы.
Окано и его команда надеются, что в будущем можно будет выращивать такие трансплантаты для использования у людей с тяжелой сердечной недостаточностью. Тот же общий подход может применяться и для создания тканей, имитирующих ткань печени или почек.

Самостоятельная сборка

Другие исследователи в большей степени полагаются на собственную способность клеток собираться в сложные структуры. Стволовые клетки, выращенные в суспензии, при определенных условиях формируют организованные скопления, называемые органоидами, и такие кластеры были получены для различных тканей — к примеру, кишечника, почек и сетчатки. Органоиды, как правило, гораздо меньше, чем настоящий орган, всего несколько миллиметров в поперечнике и имеют гораздо более простой набор клеток, но некоторые исследователи сейчас получают органоиды с несколькими типами клеток и более сложным устройством, и даже пытаются смоделировать наиболее сложный орган — мозг.
Одной из известных попыток практического применения технологий выращивания живых тканей стал синтетически выращенный в 2013 г. кусочек мяса для гамбургера, который был пожарен и демонстративно съеден перед телекамерами. Кусок состоял из более чем 20 тыс. клеток мышечной ткани коровы. На выращивание ушло три месяца, обошелся эксперимент в $300 тыс. — подобные технологии пока нельзя назвать доступными
В 2013 году Мадлен Ланкастер (Madeline Lancaster) и Юрген Кноблих (Juergen Knoblich) из Института молекулярной биотехнологии Австрийской академии наук в Вене получили органоиды ткани мозга человека размером с чечевичное зерно. Исходной ступенью их опытов были группы плюрипотентных стволовых клеток человека, которые дифференцируются в нервную ткань. Запланированной частью методологии было дать биологической программе идти своим ходом.

При правильных условиях клетки в ходе дифференциации самоорганизовываются в тугое сплетение нервной ткани с несколькими типами клеток, включая радиальные глии, предшественники таких клеток мозга как нейроны. В этом сплетении можно даже различить рудиментарные структуры мозга — зачатки переднего мозга и сетчатки.
«Мы, в общем-то, практически воспроизводим процесс формирования нервной ткани в пробирке, позволяя ему развиваться так, как это происходит в эмбрионе», — говорит Кноблих.
Эти мозговые органоиды помогают справиться с вопросами, на которые трудно ответить с помощью нейронов, выращенных на плоской поверхности чашки Петри. Венские исследователи работают над изучением микроцефалии, нарушения развития нервной системы человека, при котором у детей развивается мозг значительно меньшего размера. Хотя это заболевание можно смоделировать и на лабораторных животных, в случае с ними разница в размерах мозга далеко не так значительна. Но когда удалось перепрограммировать клетки кожи от пациентов с микроцефалией в плюрипотентные клетки, из которых затем развились мозговые органоиды, полученные структуры имели четкие признаки заболевания.
В этих органоидах радиальные глии разрастались в меньшей степени, а в некоторых областях преждевременно дифференцировались в нейроны. Даже при нормальных условиях в развитии подопытных мышей радиальные волокна глий распространяются не так, как в организме человека. Таким образом, органоиды человека являются перспективным способом изучения участия этих предшественников нервных клеток в формировании болезни.
Ланкастер и Кноблих также использовали органоиды для оценки влияния гена под названием CDK5RAP2, управляющего процессом деления клеток. У пациента с микроцефалией была выявлена мутация в этом гене, что, вероятно, приводит к синтезу аномального белка. Когда в органоид ввели неповрежденный белок, некоторые клетки превратилась в подобие радиальных глий, что указывает на участие дисфункции этого гена в формировании микроцефалии.

Органостроение

Вместо замены поврежденных или больных органов, некоторые исследователи работают над стимулированием их регенерации. Вмешательство во внутренние химические и биоэлектрические сигналы плоских червей позволило вызвать развитие второй головы. Регенерация происходит потому, что новый сигнал сохраняется по всей биоэлектрической сети животного. 

1) Нормальный взрослый плоский червь.

2) Манипуляции над биоэлектрической сетью червя.

3) Измененное строение червя, полученное редактированием памяти клеток о том, что должно быть регенерировано.
В технологии создания органоидов есть еще много вопросов. Ланкастер и Кноблих отмечают, что их органоидам не хватает кровоснабжения и взаимодействия с окружающей тканью, обычно присущего нервной ткани. Со временем органоиды начинают умирать и терять сходство с ранней мозговой тканью. Их удавалось сохранить живыми в течение целого года, но насколько органоиды поздней стадии годятся для исследований заболеваний, еще предстоит выяснить, говорит Кноблих.
Еще одной проблемой является предсказуемость результата, поскольку органоиды принимают различную форму от одной партии к другой, говорит он. Лаборатория продолжает экспериментировать с условиями выращивания в надежде решить эти проблемы и найти способ моделировать более сложные нарушения развития нервной системы.

Подобно эмбриону

Создатели моделей органов могут также использовать для своих целей межклеточные сигналы  — множество биохимических и биоэлектрических инструкций, повинуясь которым, клетки дифференцируются, мигрируют, меняют форму или собираются вместе, образуя орган. Этот подход уже был использован для регенерации лапок у лягушек, слишком взрослых, чтобы отрастить ампутированную конечность естественным образом. Данная работа, возглавляемая Майклом Левином (Michael Levin), биомедицинским инженером в Университете Тафтса в г. Медфорд, штат Массачусетс, не так далека от человеческой физиологии, как можно подумать: и у человека дети могут регенерировать кончики пальцев, а взрослые — нет.
Чтобы заставить лягушачьи лапки расти заново, Левин и его команда химически изменили рисунок электрического заряда в конечности так, чтобы он соответствовал биоэлектрическому градиенту, обнаруженному в конечностях молодого животного, и это побудило клетки на поврежденной лапке к росту. Им удалось также вызвать образование плоского червя с двумя головами (см. врезку). Модификация биоэлектрических сигналов вызвала постоянное изменение в памяти о том, что нужно сформировать, закодированной в электрическом виде подобно воспоминаниям в нашем мозге. Левин описывает свой опыт как «манипулирование информацией» в тканях так, что она вызывает предсказуемые и значительные изменения в росте и форме. Это, как он говорит, «сильно упрощает выращивание чего бы то ни было».
Вместо того, чтобы вникать во все детали роста нового органа и пытаться его контролировать, Левин верит в использование собственных процессов организма. Он и его команда разрабатывают физиологический «разговорник» из математических моделей и программного обеспечения. Эти программные средства можно использовать для поиска параметров, которые могут быть измененены в эксперименте, и получения возможности таким образом сообщить клеткам, какие ткани строить. Задача состоит в том, чтобы привязать наборы данных о генах, белках и сигнальных путях к пониманию того, как задается форма и функция органов.
«Такого рода инструменты будут незаменимы при преодолении барьера сложности, возникающего при создании даже простых органов», — говорит Левин.

В конечном счете важна полезность инструмента, а не выбор конкретного подхода для его применения. Выращенные ткани уже сегодня позволяют проводить как неожиданные эксперименты, так и заместительную терапию с их применением. И стремление максимально точно повторить природу при их создании — не всегда самый оптимальный подход.

«Главное — то, достаточно ли полученный орган сложен для выполнения своей функции», — говорит Хунцикер.

Заплатки для поврежденных сердец, более совершенные испытания на токсичность или прорыв в понимании разрушительной болезни мозга — искусственные ткани дают именно то, чего жаждут ученые: научные знания и возможность помочь людям.ё